Principio De Genereader - Qiagen GeneReader Manual Del Usuario

3.2

Principio de GeneReader

El flujo de trabajo incluye los siguientes seis (6) procesos:
hibridación de los cebadores de secuenciación;

preparación de las celdas de flujo;

preparación de los reactivos;

configuración del experimento;

carga de la celda de flujo e inicio de la serie;

lavado de mantenimiento posterior a la serie.

A continuación, se describe el fundamento de una serie de secuenciación en el instrumento
GeneReader.
El primer paso de la tecnología de secuenciación por síntesis del instrumento GeneReader consiste
en la incorporación de desoxirribonucleótidos trifosfato (dNTP) exclusivos que están marcados
mediante fluorescencia y unidos a terminadores reversibles. A estos dNTP se les denomina
"nucleótidos marcados". A esto le sigue la adición de los dNTP no marcados unidos a terminadores
reversibles o "nucleótidos oscuros".
La química de secuenciación del instrumento GeneReader emplea cuatro colorantes para marcar
cada uno de los dNTP a fin de diferenciar todas las bases (A, C, G o T) incorporadas en el
fragmento de ADN. Además, los terminadores reversibles facilitan la adición de nucleótidos
manipulados de uno en uno a la cadena en crecimiento de todos los ADN molde. Tras la detección
de señales de cada microesfera, se eliminan los marcadores fluorescentes y los terminadores para
permitir la realización de un nuevo ciclo de incorporación; esto garantiza una secuenciación de
alto rendimiento rentable y muy exacta.
Las genotecas de ADN se someten a amplificación clonal en microesferas con el instrumento
GeneRead QIAcube para que sirvan como molde de secuenciación. Tras la hibridación de un
cebador de secuenciación, se inmovilizan las microesferas que contienen los moldes y los
cebadores mediante una interacción directa entre las microesferas y el vidrio a fin de producir una
matriz de alta densidad en una celda de flujo de GeneReader. Para leer el contenido de los moldes
que tiene cada microesfera, primero se utilizan reactivos que contienen dNTP manipulados de
manera exclusiva, como se ha descrito anteriormente, en la matriz de fragmentos. Estas bases se
incorporan, mediante la adición de una ADN polimerasa modificada, al extremo de la cadena de
ADN en crecimiento de conformidad con la base de la cadena complementaria. Posteriormente,
una cámara digital de alta resolución escanea la matriz y se cuantifica y registra el resultado de
la fluorescencia de cada uno de los cuatro colorantes. Por último, se expone la matriz a una
Manual del usuario de QIAGEN GeneReader 12/2017 22