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Idiomas disponibles
Idiomas disponibles
déplacement de brin (Strand Displacement Amplification, SDA) d'une séquence cible spécifique en présence d'une
sonde de détection couplée à un marqueur fluorescent.
PRINCIPES DE LA METHODE
Le dosage BD ProbeTec CT Q
transport d'échantillons BD ProbeTec Chlamydia trachomatis/Neisseria gonorrhoeae (CT/GC) Q
le système BD Viper et l'extraction BD FOX. Les échantillons sont prélevés et transportés dans leurs dispositifs
respectifs, qui préservent l'intégrité de l'ADN de C. trachomatis dans les plages de température et pendant les délais
indiqués.
L'urine et les écouvillons sont soumis à un préchauffage dans le bloc chauffant BD Viper pour dissoudre le mucus et
homogénéiser l'échantillon. Une fois refroidis, les échantillons sont placés dans l'instrument BD Viper, qui effectue
alors toutes les étapes nécessaires pour extraire et amplifier l'ADN cible, sans aucune intervention supplémentaire
de la part de l'utilisateur. L'échantillon est transféré dans un tube d'extraction qui contient des particules d'oxyde
ferrique dans un film soluble ainsi qu'un témoin d'extraction déshydraté. Un pH élevé est utilisé pour effectuer la lyse
des cellules bactériennes et libérer leur ADN dans la solution. De l'acide est ensuite ajouté pour réduire le pH et créer
une charge positive sur l'oxyde ferrique, qui se lie alors à l'ADN négativement chargé. Les particules et l'ADN fixé sont
ensuite attirés vers les bords du tube d'extraction par des aimants, et l'échantillon traité est aspiré et mis au rebut. Les
particules sont lavées et un tampon d'élution à haut pH est ajouté pour récupérer l'ADN purifié. Enfin, un tampon de
neutralisation est utilisé pour optimiser le pH de la solution extraite en vue de l'amplification de l'ADN cible.
Le dosage BD ProbeTec CT Q
cible en utilisant des amorces d'amplification et une sonde de détection couplée à un marqueur fluorescent.
réactifs pour l'amplification SDA sont déshydratés dans deux micropuits jetables distincts : le micropuits d'amorçage,
qui contient les amorces d'amplification, la sonde de détection couplée à un marqueur fluorescent, les nucléotides
et d'autres réactifs requis pour l'amplification, et le micropuits d'amplification, qui contient les deux enzymes
nécessaires pour la procédure SDA (une ADN polymérase et une endonucléase de restriction). L'automate BD Viper
transfère une partie de la solution d'ADN purifié de chaque tube d'extraction dans un micropuits d'amorçage pour en
réhydrater le contenu. Après une brève incubation, le mélange réactif est transféré dans le micropuits d'amplification
préchauffé correspondant, qui est scellé pour empêcher toute contamination puis incubé dans l'un des deux lecteurs
de fluorescence thermorégulés. La présence ou absence d'ADN de C. trachomatis est déterminée en calculant la
fluorescence maximale (nombre maximum d'unités relatives de fluorescence, ou MaxRFU) au cours de la procédure
d'amplification et en la comparant à une valeur de seuil prédéterminée.
Outre la sonde fluorescente utilisée pour détecter l'ADN cible amplifié de C. trachomatis, un second oligonucléotide
couplé à un marqueur fluorescent est incorporé à chaque réaction. Utilisé en guise de témoin d'extraction (Extraction
Control, EC), cet oligonucléotide est marqué avec un colorant différent de celui utilisé pour le dépistage de l'ADN
cible spécifique de C. trachomatis et sert à confirmer la validité de la procédure d'extraction. L'EC est déshydraté
dans les tubes d'extraction, puis réhydraté lorsque l'échantillon et les réactifs d'extraction sont ajoutés. A la fin du
processus d'extraction, la fluorescence du témoin d'extraction est mesurée par l'instrument BD Viper et un algorithme
automatisé est appliqué aussi bien aux signaux du témoin qu'aux signaux spécifiques de C. trachomatis pour
déterminer si le résultat est positif, négatif ou un échec de l'EC.
REACTIFS
Chaque jeu de réactifs BD ProbeTec CT Q
CT Q
x
Amplified DNA Assay Priming Microwells (micropuits d'amorçage pour le dosage d'ADN amplifié CT Q
12 x 96 : chaque micropuits d'amorçage contient environ 110 pmol d'oligonucléotides, 45 pmol de sonde de détection
couplée à un marqueur fluorescent, 80 nmol de dNTP ainsi que des stabilisants et tampons.
CT Q
x
Amplified DNA Assay Amplification Microwells (micropuits d'amplification pour le dosage d'ADN amplifié CT
Q
x
), 12 x 96 : chaque micropuits d'amplification contient environ 100 unités d'ADN polymérase et 620 unités d'enzyme
de restriction ainsi que des stabilisants et tampons.
REMARQUE : chaque sachet de micropuits contient un sachet de dessiccatif.
Control Set for the BD ProbeTec CT/GC Q
x
ProbeTec CT/GC Q
) : 24 tubes de témoins positifs CT/GC Q
linéarisés pCTB4 et pGCint3 dans un acide nucléique porteur, et 24 tubes de témoins négatifs CT/GC Q
uniquement de l'acide nucléique porteur. Les concentrations des plasmides pCTB4 et pGCint3 sont déterminées par
spectrophotométrie UV.
CT/GC Q
x
Swab Diluent for the BD ProbeTec CT/GC Q
dosages d'ADN amplifié BD ProbeTec CT/GC Q
potassium/hydroxyde de potassium avec du DMSO et un agent de conservation.
BD FOX Extraction Tubes for the BD ProbeTec CT/GC Q
dosages d'ADN amplifié BD ProbeTec CT/GC Q
fer dans un film soluble et environ 240 pmol d'oligonucléotide couplé à un marqueur fluorescent en guise de témoin
d'extraction.
Extraction Reagent and Lysis Trough for the BD ProbeTec CT/GC Q
d'extraction et de lyse pour dosages d'ADN amplifié BD ProbeTec CT/GC Q
quatre cavités contient environ 16,5 mL d'acide de liaison, 117 mL de tampon de lavage, 35 mL de tampon d'élution
et 29 mL de tampon de neutralisation avec agent de conservation ; chaque cuve de lyse contient environ 11,5 mL de
réactif de lyse.
INSTRUMENT, MATéRIEL ET CONSOMMABLES
Matériaux fournis : BD Viper Instrument (instrument BD Viper), BD Viper Instrument Plates (plaques pour instrument
BD Viper), BD Viper Pipette Tips (embouts de pipettes BD Viper), BD Viper Tip Waste Boxes (collecteurs de déchets
BD Viper), BD Viper Amplification Plate Sealers (Black) (bandes d'étanchéité noires pour plaques d'amplification
BD Viper), BD Viper Lysing Heater (bloc chauffant de lyse BD Viper), BD Viper Lysing Rack (portoir de lyse BD Viper),
BD Viper Neutralization Pouches (sachets de neutralisation BD Viper, Specimen Tubes and Caps for use on the BD Viper
(Extracted Mode) (tubes d'échantillons et bouchons pour utilisation sur le système BD Viper en mode Extraction), Urine
x
Amplified DNA Assay est conçu pour être utilisé avec les systèmes de prélèvement et de
x
Amplified DNA Assay effectue l'amplification et la détection simultanées de l'ADN
x
contient :
x
Amplified DNA Assays (jeu de témoins pour dosages d'ADN amplifié
x
) : 48 tubes contenant chacun environ 2 mL de tampon phosphate de
x
) : 48 barrettes de 8 tubes contenant chacun environ 10 mg d'oxyde de
8,9
x
contenant environ 2 400 copies de chaque des plasmides
x
Amplified DNA Assays (diluant d'écouvillonnage CT/CG Q
x
Amplified DNA Assays (tubes d'extraction BD FOX pour
x
Amplified DNA Assays (cuves de réactifs
x
) : chaque cuve de réactifs d'extraction à
25
x
, les réactifs appropriés,
8,9
Les
x
),
x
contenant
x
pour
Capítulos
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