Desnaturalización De Bibliotecas Y Adición De Control Phix Opcional; Preparación De La Placa De Reactivos De Cbot; Preparación De La Reacción De Examp - Illumina cBot Guía Del Sistema

Guía del sistema cBot
Desnaturalización de bibliotecas y adición de control PhiX opcional
La concentración de carga de bibliotecas depende de las bibliotecas que se vayan a secuenciar. Las
instrucciones siguientes se aplican a las bibliotecas ADN TruSeq Nano (350 pb) o ADN TruSeq PCR-Free
(350 pb). Diluya a una concentración adecuada para al tipo de biblioteca.
Una concentración de carga de ADN demasiado alta provoca un % PF reducido.
u
Una concentración de carga de ADN demasiado baja provoca un % PF reducido, así como un elevado
u
porcentaje de duplicados que afecta de forma negativa a la profundidad de cobertura.
Repita estas instrucciones para cada celda de flujo que vaya a secuenciar.
1 Diluya la biblioteca o el conjunto de bibliotecas a la concentración adecuada:
Bibliotecas de ADN TruSeq Nano: diluir a 2-3 nM en RSB.
u
Bibliotecas de ADN TruSeq PCR-Free: diluir a 1-2 nM en RSB.
u
2 [Opcional] Añadir control PhiX no desnaturalizado de Illumina al 1 % a las bibliotecas no desnaturalizadas:
Bibliotecas de ADN TruSeq Nano: añadir 0,5 µl de PhiX de 2-3 nM a 50 µl de biblioteca de 2-3 nM.
u
Bibliotecas de ADN TruSeq PCR-Free: añadir 0,5 µl de PhiX de 1-2 nM a 50 µl de biblioteca de
u
1-2 nM.
3 Etiquete los tubos de las gradillas de ocho tubos del 1 al 8.
4 Desnaturalice la biblioteca en la gradilla de ocho tubos del modo siguiente.
a Añada 5 µl de biblioteca no desnaturalizada al fondo de cada pocillo.
b Añada 5 µl de NaOH 0,1 N recién diluido. Realice un pipeteo suave para mezclarlo.
c Incube a temperatura ambiente durante 8 minutos.
d Añada 5 µl de Tris-HCl 200 mM pH 8.0. Realice un pipeteo suave para mezclarlo.
5 Reserve en hielo hasta que esté listo para añadir la mezcla maestra ExAmp.
PRECAUCIÓN
Prepare y añada la mezcla maestra ExAmp en un plazo de 30 minutos.
Preparación de la placa de reactivos de cBot
1 Invierta para mezclar.
2 Agite en un vórtice para eliminar cualquier burbuja de aire atrapada.
3 Golpee sobre una superficie dura para recoger cualquier gota de reactivo. De forma alternativa, pulse en
centrifugar.
4 Reserve en hielo.
Preparación de la reacción de ExAmp
Prepare la mezcla maestra de la reacción de ExAmp inmediatamente antes de su uso. Siga las instrucciones
adecuadas según la cantidad de celdas de flujo que prepare.
Reacción de ExAmp para una celda de flujo (kit de paquetes de una unidad)
1 Invierta EPX1 y EPX2 para mezclarlos.
2 Centrifugue brevemente EPX1, EPX2 y EPX3.
N.º de documento 15006165 v05 ESP
Para uso exclusivo en investigación.
Prohibido su uso en procedimientos de diagnóstico.
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