Desnaturalización De Bibliotecas Y Adición De Control Phix Opcional; Preparación De La Placa De Reactivos De Cbot - Illumina cBot 2 Guía Del Sistema

Guía del sistema cBot 2
Desnaturalización de bibliotecas y adición de control PhiX opcional
La concentración de carga de bibliotecas depende de las bibliotecas que se vayan a secuenciar. Las
instrucciones siguientes se aplican a las bibliotecas de nanomuestras de ADN TruSeq (350 pb) o ADN TruSeq
sin PCR (350 pb). Diluya a una concentración adecuada para al tipo de biblioteca.
Una concentración de carga de ADN demasiado alta provoca un % PF reducido.
u
Una concentración de carga de ADN demasiado baja provoca un % PF reducido, así como un elevado
u
porcentaje de duplicados que afecta de forma negativa a la profundidad de cobertura.
Repita estas instrucciones para cada celda de flujo que vaya a secuenciar.
1 Diluya la biblioteca o el conjunto de bibliotecas a la concentración adecuada:
Bibliotecas de nanomuestras de ADN TruSeq: diluir con 2–3 nM en RSB.
u
Bibliotecas de ADN TruSeq sin PCR: diluir con 1–2 nM en RSB.
u
2 [Opcional] Añada control PhiX no desnaturalizado de Illumina al 1 % a las bibliotecas no desnaturalizadas:
Bibliotecas de nanomuestras de ADN TruSeq: añadir 0,5 µl de PhiX de 2–3 nM a 50 µl de biblioteca
u
de 2–3 nM.
Bibliotecas de ADN TruSeq sin PCR: añadir 0,5 µl de PhiX de 1–2 nM a 50 µl de biblioteca de 1–2 nM.
u
3 Número de tubos de una gradilla de ocho tubos:
Para la generación de grupos con seguimiento de muestras: desde el extremo con la clave, etiquete
u
los tubos de 8 a 1.
Para la generación de grupos sin seguimiento de muestras: etiquete los tubos de 1 a 8. Al preparar
u
cuatro celdas de flujo, plantéese añadir otro indicador en la gradilla de ocho tubos para un realizar un
seguimiento adecuado.
4 Desnaturalice la biblioteca en la gradilla de ocho tubos del modo siguiente.
a Añada 5 µl de biblioteca no desnaturalizada al fondo de cada pocillo.
b Añada 5 µl de NaOH 0,1 N recién diluido. Realice un pipeteo suave para mezclarlo.
c Incube a temperatura ambiente durante 8 minutos.
d Añada 5 µl de Tris-HCl 200 mM, pH 8,0 Realice un pipeteo suave para mezclarlo.
5 Resérvelo sobre hielo hasta que esté listo para añadir la mezcla maestra ExAmp.
PRECAUCIÓN
Prepare y añada la mezcla maestra ExAmp en un plazo de 30 minutos.
Preparación de la placa de reactivos de cBot
1 Invierta para mezclar.
2 Agite en un vórtice para eliminar cualquier burbuja de aire atrapada.
3 Golpee sobre una superficie dura para recoger cualquier gota de reactivo. Otra opción es pulsar en
centrifugar.
4 Déjela reposar en hielo.
N.º de documento 15065681 v05 ESP N.º de material 20015507
Para uso exclusivo en investigación.
Prohibido su uso en procedimientos de diagnóstico.
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