Tabla de contenido
10 Análisis de disociación de alta resolución
Los análisis de disociación de alta resolución (High resolution melt, HRM) conforman una técnica
innovadora basada en la disociación de ADN. Los HRM caracterizan las muestras de ADN según
su comportamiento de disociación a medida que pasan de ADN bicatenario (ADNbc) a ADN
monocatenario (ADNmc) con un aumento de temperatura (consulte la figura que aparece a
continuación). Los instrumentos de HRM recogen las señales fluorescentes con gran precisión óptica
y térmica, lo que ofrece una amplia gama de posibilidades de aplicación.
Fase de
predisociación
Gráfico de HRM típico. La curva de disociación marca la transición desde un nivel de fluorescencia elevada en la fase de
predisociación inicial, a medida que disminuye durante la fase de disociación y hasta el nivel basal de fluorescencia en la
fase de posdisociación. La fluorescencia disminuye a medida que el colorante de intercalado de ADN se libera del ADNbc
mientras se disocia en cadenas únicas. El punto medio de la fase de disociación, a la que la velocidad de cambio de
fluorescencia es mayor, define la temperatura de disociación (melting temperatura, Tm) del ADN objeto de análisis.
Antes de llevar a cabo el análisis de HRM, debe ampliarse la secuencia objetivo a un número de
copias elevado. Esto suele llevarse a cabo mediante PCR en presencia de un ADNbc que se
intercala con un colorante fluorescente. El colorante no interactúa con el ADNmc, pero se
intercalará activamente con el ADNbc y emitirá fluorescencia al intercalarse. El cambio en la
fluorescencia se puede utilizar para medir el aumento en las concentraciones de ADN durante las
PCR y, posteriormente, para medir directamente la disociación de ADN termoinducida por HRM.
Durante el HRM, la fluorescencia será elevada al inicio porque la muestra comienza como ADNbc.
Posteriormente, la fluorescencia disminuirá a medida que se eleva la temperatura y el ADN se
disocia en cadenas únicas. El comportamiento de disociación que ocurre es característico de una
muestra de ADN concreta.
Manual del usuario de Rotor-Gene Q MDx CE 02/2022
Curva de
disociación
Fase de
disociación
Fase de
posdisociación
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Solución de problemas
