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Análisis de curvas de disociación de alta resolución
Utilice suficiente plantilla de preamplificación
El análisis de los datos PCR en tiempo real puede ser
muy útil para la localización y la solución de errores en
los análisis HRM. Los gráficos de amplificación deben
presentar un valor C
(ciclo umbral) menor o igual a 30
T
ciclos. Los productos que amplifican en un momento
posterior (debido a una cantidad baja de plantilla de
iniciación o a la degradación de la plantilla)
producen normalmente resultados HRM variables
debido a los artefactos PCR.
Normalice la concentración de la plantilla
La cantidad de plantilla añadida a la reacción debe
ser uniforme. Normalice las concentraciones de inicio
para que todos los gráficos de amplificación solo
difieran entre sí tres valores C
. De este modo se
T
asegurará que las concentraciones introducidas se
encuentren en un rango de 10x.
Compruebe si existen gráficos de amplificación
atípicos
Antes de realizar un análisis HRM, examine con
cuidado si los datos del gráfico de amplificación
presentan una forma anómala. Los gráficos con una
fase logarítmica-lineal que no presenta una
pendiente, que presenta picos o que alcanza una
meseta de señal baja en comparación con otras
reacciones pueden indicar una amplificación
deficiente o una señal de fluorescencia demasiado
baja (p. ej. esto puede ocurrir con una concentración
de cebador demasiado baja). Las reacciones
deficientes pueden estar causadas por inhibidores de
la reacción o por una preparación incorrecta de la
reacción. Los datos HRM procedentes de estas
muestras pueden ser inconcluyentes o de baja
resolución. Para evitar resultados poco fiables,
recomendamos que utilice los kits de QIAGEN para la
preparación de las muestras y el análisis HRM.
Manual del usuario Rotor-Gene Q MDx 09/2018
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