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Apéndice B
Para asegurar una amplificación equitativa en un ensayo CpG,
se puede mezclar ADN no metilado con proporciones
crecientes de ADN totalmente metilado. Recomendamos utilizar
los ADN de control EpiTect que proporcionan ADN tratado con
bisulfito totalmente metilado y sin metilar en soluciones listas
para usar. Los análisis de regresión de la frecuencia de un
alelo medida en el PyroMark Q24 MDx como función del alelo
introducido (esperado) deben proporcionar un valor R
2
mayor
que 0,9.
Para un ensayo AQ, las variantes alélicas, incluida la
posición variable, se pueden mezclar a diferentes
concentraciones de forma similar al método utilizado para
un ensayo CpG. Si la posición variable en un ensayo AQ es
un SNP, el modo más fácil de comprobar la amplificación
equitativa es comparar las alturas de los picos de un
heterocigoto. Si el SNP está representado por la
incorporación de bases simples, p. ej., AAC/TGG, los dos
alelos (picos C y T) deben proporcionar picos de altura
idéntica. Un heterocigoto InDel debe proporcionar una
deleción del 50%.
Preparación de la muestra
Utilice 5–20 µl de una PCR de 25 µl para la inmovilización a
la estreptavidina sefarosa de alto rendimiento (Streptavidin
Sepharose High Performance, GE Healthcare) según las
instrucciones de la sección 5.3.3. Esto equivaldrá a
aproximadamente 0,5–4 picomoles de producto de la PCR,
según la eficacia de la PCR.
Nota: Si utiliza el kit PyroMark PCR, 5–10 µl del producto de
la PCR proporcionarán en la mayoría de los casos resultados
de pirosecuenciación satisfactorios. Este volumen se debe
ajustar para obtener alturas de pico individuales de al
menos 40 RLU en el pirograma.
Análisis de pirosecuenciación
Si no se indica lo contrario, utilice los ajustes
predeterminados del software para todas las preparaciones
de ensayos.
Manual de usuario del PyroMark Q24 MDx 01/2016
B-5
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