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Apéndice B
Cantidad del molde de iniciación
La eficacia del annealing de un cebador a un molde es un
factor importante en la PCR. Debido a la naturaleza
termodinámica de la reacción, la relación cebador:molde
influye en gran medida en la especificidad y eficacia de la
PCR y se deberá optimizar de forma empírica. Si se utiliza
una cantidad insuficiente de molde, es posible que los
cebadores no sean capaces de encontrar sus secuencias
complementarias. Una cantidad excesiva de molde puede
provocar un aumento de los errores de cebado.
Optimización de la PCR
El kit PyroMark PCR producirá resultados satisfactorios en la
mayoría de los casos. No obstante, si es necesaria una
mayor concentración de Mg
25 mM MgCl
La temperatura de annealing recomendada es de 60 °C
para el ADN genómico y de 56 °C para el ADN tratado con
bisulfito si se utiliza el PyroMark ADSW 2.0.
La adición de Q-Solution
PyroMark PCR) puede mejorar el rendimiento y la
especificidad de la PCR para moldes difíciles que, por
ejemplo, presenten un nivel elevado de estructuras
secundarias o de moldes ricos en GC.
Para todas las pruebas de optimización de la PCR, analice
5 µl de una PCR de 25µl en un gel de agarosa e intente
obtener una banda específica intensa con un exceso mínimo
de cebadores.
Para la localización y la resolución de otras anomalías,
consulte el Manual PyroMark PCR.
Amplificación equitativa de los dos alelos en ensayos
AQ y CpG
La obtención de resultados fiables en los ensayos de
cuantificación depende de la amplificación equitativa de los
dos alelos; esto se debe comprobar con suma diligencia.
B-4
proporcionado en el kit.
2
®
Manual de usuario del PyroMark Q24 MDx 01/2016
2+
, recomendamos utilizar el
(proporcionada con el kit
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