Tabla de contenido
Apéndice B
Diseño y validación del ensayo
Diseño del ensayo
Los ensayos de pirosecuenciación se pueden diseñar con la
versión más reciente del PyroMark Assay Design Software
(ADSW) (Software de diseño de ensayos PyroMark Assay). El
programa generará automáticamente juegos de cebadores
que incluyen cebadores PCR y de secuenciación. Cada juego
de cebadores recibirá una puntuación de calidad basada en
varios parámetros específicos del análisis de
pirosecuenciación. Asegúrese de utilizar el tipo de ensayo
correcto en el PyroMark ADSW. Recomendamos utilizar para
la pirosecuenciación ensayos de QIAGEN con etiqueta DIV
que incluyan todos los cebadores optimizados necesarios.
PCR
Para la amplificación por PCR recomendamos utilizar el kit
PyroMark PCR (QIAGEN), que se ha optimizado
específicamente para los análisis de pirosecuenciación y que
permite una amplificación altamente específica y sin sesgo
del molde de ADN para diferentes aplicaciones de
pirosecuenciación como, p. ej., la detección de mutaciones,
el análisis SNP, el análisis de metilación y la lectura
automática de nucleótidos. El práctico formato de mezcla
maestra permite realizar una amplificación específica de
diferentes materiales partida, tales como el ADN genómico
de diversas especies, así como el ADN convertido con
bisulfito, mediante un único protocolo.
Cebadores PCR
Uno de los cebadores debe estar etiquetado con biotina
para permitir la inmovilización de las microesferas
recubiertas de estreptavidina (Streptavidin Sepharose High
Performance; GE Healthcare) durante la preparación de un
molde de ADN monocatenario. La orientación del ensayo
puede ser directa o inversa. Si diseña cebadores con el
Manual de usuario del PyroMark Q24 MDx 01/2016
Apéndice B
B-1
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