Teoría De La Fluorescencia - Waters ACQUITY UPLC Guia De Inicio Rapido

Teoría de la fluorescencia
La fluorescencia tiene lugar cuando algunas moléculas absorben luz a
determinadas longitudes de onda, lo que produce el ascenso de éstas a un
estado superior de energía. Al volver a su estado de energía normal, las
moléculas "excitadas" liberan la energía absorbida en forma de fotones.
Muchos compuestos orgánicos absorben luz, pero pocos emiten fluorescencia.
Los sistemas LC que incorporan detección de fluorescencia identifican con efi-
cacia hidrocarburos poliaromáticos, aflatoxinas, vitaminas, aminoácidos, etc.
Los métodos de derivatización química amplían la detección de fluorescencia a
algunos compuestos no fluorescentes como los pesticidas de carbamato.
La detección de fluorescencia requiere tanto de una longitud de onda de
excitación como de una de emisión, logrando obtener un grado superior de
sensibilidad. Como resultado, esta técnica es útil para análisis que requieren
límites de detección bajos.
Algunas condiciones pueden interferir con la capacidad de un compuesto de
emitir fluorescencia, disminuyendo el rendimiento analítico:
• Cambios de pH: la pérdida o ganancia de protones y el incremento o
disminución de carga asociado afecta a la estructura electrónica de un
analito y puede aumentar o disminuir la fluorescencia.
• Cambios de temperatura: la intensidad de fluorescencia disminuye a
medida que la temperatura de la muestra aumenta.
• Cambios de la cantidad de oxígeno disuelto: en algunas moléculas la
presencia de oxígeno disuelto disminuye la fluorescencia.
Los detectores de fluorescencia se pueden adaptar para medir la
quimioluminiscencia, con la que una molécula sin exposición a ninguna
energía de excitación emite una señal de intensidad baja. Este tipo de
detección se puede adaptar desactivando la fuente de luz o (como en el caso de
este detector) colocando un obturador para impedir que llegue luz de
excitación a la cubeta de flujo.
El proceso de detección de fluorescencia comprende una fuente de excitación y
los siguientes procesos:
• Filtración de la luz de la fuente.
• Excitación de la muestra con luz filtrada.
• Captura y filtración de la fluorescencia emitida.
• Medición de la fluorescencia emitida.
• Amplificación de la señal emitida.
1-2 Teoría de funcionamiento