Technoclone TECHNOZYM Manual Del Usario página 5

TECHNOZYM ® vWF:CBA ELISA
DESCRIPCIÓN DEL PRODUCTO
APLICACIÓN
El factor von Willebrand (vWF) es una gran glicoproteína multifunctional. Ocupa un lugar clave en la
hemostasis primaria. Tiene una estructura múltimérica con varias funciones:
 Es proteína de transporte para el factor VIII en el plasma; forma un complejo y protege por tanto al
factor VIII de una temprana descomposición proteolítica.
 Actúa como mediador de agregación de plaquetas adhiriéndose a los receptores de las membranas
de las plaquetas (GP Ib by GP Iib/IIIa) tras una activación previa de las plaquetas
 Desempeña una función en la hemostasis primaria actuando como mediador entre las plaquetas
adheridas y el subendotelio (pared vascular lesionada).
El síndrome von Willebrand (vWS) es la enfermedad hemorrágica que se da con más frecuencia;
puede ser hereditaria o adquirida, causada por defectos cuantitativos o cualitativos del vWF. La
determinación del antígeno de vWF es parte esencial del diagnóstico.
Para determinar las propiedades adhesivas del vWF, (su capacidad de adhesión a colágenos). Ayuda
en la diferenciación de las clases de la enfermedad de von Willebrand y la bioactividad de
concentrados.
COMPOSICION
1. Las tiras de pruebas ELISA (12) con 8 pocillos cada una, recubiertas con colágeno humano de tipo III; el
agente deshidratante se facilita en una bolsa de aluminio.
2. El concentrado de tampón de lavado: (PBS; pH 7,3); contiene detergente; 0,01% mertiolato; 1 frasco, 80 ml.
3.Tampón de incubación: (PBS; pH 7,3); contiene proteína estabilizadora; Proclin 300; y 1 frasco de colorante, 90
mL, listo para usarse.
4. Calibradores (estándares) numerados; liofilizados; 1 frasco de cada uno.
Las concentraciones dependen del lote; consultar la etiqueta en el vial.
5. Plasmas de control "nivel bajo" y "nivel alto" con fines de comprobación, liofilizados; 1 frasco de cada uno.
Las concentraciones dependen del lote; consultar la etiqueta en el vial.
6. Conjugado policlonal Anti-vWF-POX; teñido de azul; 1 frasco, 0,3 mL.
7. Cromógeno TMB (tetrametilbenzidina); 1 frasco, 12 mL; listo para usarse.
8. Solución parada: ácido sulfúrico 1,9 mol/l; 1 frasco, 12 mL; listo para usarse.
9. Película adhesiva para las tiras de pruebas ELISA (2).
MATERIAL NECESARIO
(no se suministra con el kit)
1. Agua destilada
2. Tubos de ensayo para diluir estándares y muestras
3. Probeta graduada (1000 mL)
4. Pipetas de precisión (10, 100 und 1000 µL)
5. Pipeta variable (1000 µL)
6. Pipetas multicanal y/o dispensadoras (100 und 200 µL)
7. Lavador ELISA o pipeta multicanal
8. Lector ELISA con filtro de 450 nm (filtro de referencia de 620 nm si resulta disponible.)
ESTABILIDAD Y CONSERVACION
Todos los componentes que contiene el kit se pueden usar hasta la fecha de caducidad indicada. La
estabilidad de referencia de los componentes después de su apertura, reconstitución y/o dilución se
puede apreciar en la tabla siguiente:
Cuando sea necesario se pueden congelar y descongelar las muestras, controles y calibradores hasta
5 veces. Sin embargo, se recomienda hacer alícuotas.
Material/Reactivo Situación
Calibradores,
después de la reconstitución
plasma de control
Tiras de pruebas después de su apertura
Concentrado de
después de su apertura
tampón de lavado
1+11,5 dilución
Tampón de lavado
concentrado
Tampón de incubación después de su apertura
después de su apertura
Conjugado
solución de empleo
Cromógeno TMB después de su apertura
MÉTODO DE LA PRUEBA
PREPERACIÓN DE LAS MUESTRAS
Material: plasma
Obtención del plasma: mézclense 9 partes de sangre venosa con 1 parte de solución de citrato sódico (0,11
mol/L) y centrifúguese durante 15 minutos a (RCF) de al menos 2500 (DIN 58905). La muestra de plasma se
puede conservar durante 3 horas a temperatura ambiente; de otra forma, la muestra se debe congelar
inmediatamente después de proceder a su centrifugación. Estable a -20° C durante 6 meses.
PREPERACIÓN DEL REACTIVO
1. Antes de iniciar la prueba, deberán ponerse a temperatura ambiente todos los componentes
necesarios.
2. Preparar el tampón de lavado: Diluir una parte de volumen de concentrado de tampón de lavado con
11,5 partes de volumen de agua destilada (1+11,5). ¡Mézclese bien! (concentrado de tampón de
lavado diluido = tampón de lavado). Pueden producirse precipitaciones cristalinas que se disolverán a
37°C en 10 minutos.
3. Calibradores de reconstitución y plasmas de control:Los calibradores y los plasmas de control se
reconstituyen con 500 µL de agua destilada y se mezclan durante 10 segundos después de un tiempo
de reconstitución de 15 minutos (mezclador Vortex). Los componentes reconstituidos resultan claros o
ligeramente turbios.
4. Diluir los calibradores, plasmas de control y muestras (1+25): Diluir muestras de 20 µL, calibradores
de 20 µL y/o controles de 20 µL respectivamente con 500 µL de tampón de incubación. ¡Mézclese
durante 10 segundos!
5. Preparar la solución de empleo de conjugado (1+50): Diluir 1 parte de volumen de conjugado con 50
partes de volumen de tampón de incubación:
Para 8 pocillos: Mezclar 20 µL de conjugado con 1000 µL de tampón de incubación.
MÉTODO DE LA PRUEBA
calibradores diluidos pipetear los plasmas de
INCUBACIÓN DE LA
control y muestras en pocillos de pruebas.
MUESTRA
Cubrir las tiras de pruebas con una película.
(referencia 1, 2)
incubar a temperatura ambiente
LAVADO (referencia 1,3,4) tampón de lavado
pipetear la solución de empleo de conjugado
REACCIÓN DE
en pocillos, cubrir las tiras de pruebas con una
CONJUGADO
película
(referencia 1,2)
incubar a temperatura ambiente
LAVADO (referencia 1,3,4) tampón de lavado
pipetear la solución de substrato en pocillos.
REACCIÓN DE
Cubrir las tiras de pruebas con una película.
SUBSTRATO
(referencia 1,2) Incubar a temperatura ambiente
SOLUCIÓN PARADA
pipetear la solución de parada en los pocillos
(referencia 1,2)
MEDICIÓN (referencia 5, 6) Lector ELISA, 450 nm
Conservación Estabilidad
temperatura ambiente 8 horas
-20°C 6 meses
2...8 °C con pelicula adhesiva
fecha en una bolsa de plástico con
caducidad
deshidratante
2...8°C 6 meses
de
2...8°C 3 semanas
2...8°C 2 meses
2...8°C 6 meses
temperatura ambiente 60 minutos
fecha
2...8°C
caducidad
100 µL
45 minutos
3 x 200 µL
100 µL
45 minutos
3 x 200 µL
100 µL
15 minutos
100 µL
Advertencias
1. No se deben combinar los reactivos de diferentes lotes
2. La precisión y reproducibilidad dependen principalmente, entre otras cosas, de los siguientes
factores:
 La mezcla a fondo todas las substancias empleadas en la dilución
 Deben probarse los calibradores de pruebas, controles y muestras en duplicado
 La incubación debe llevarse a cabo a temperaturas adecuadas (La temperatura ambiente es de entre
20...25°C)
 La estricta observancia del orden en que se llevan las pruebas con la pipeta y el elemento de tiempo
indicado
 El tiempo indicado para la incubación de la muestra, la reacción de conjugado y de substrato se
inicia tras efectuar la prueba de la última muestra con la pipeta. Los tiempos de incubación no
deberán variar en más de ±10%.
 Durante la incubación de la muestra y la reacción de conjugado, el tiempo para pipetear los
calibradores/muestras/plasmas de control y/o soluciones de conjugado diluidos, no debe exceder de
60 segundos para la tira de prueba ELISA (8 pocillos).
 Durante la reacción de substrato y el stop, el tiempo necesario para pipetear el substrato y/o la
solución parada no debe exceder de 10 segundos por cada tira de prueba ELISA. Se podrán lograr
tiempos breves en las pruebas usando pipetas multicanal y dispensadoras.
3.Indicar el número en las tiras con un lapiz resistente al agua para el caso en de que se desprendan
accidentalmente de su sitio durante la realización de la prueba.
4. Después del último lavado, los pocillos deben ser aspirados a fondo, darlos la vuelta y colocarlos
sobre un papel absorbente; los últimos residuos se deben eliminar golpeando suavemente.
5.Mediante la medición de la diferencia en longitudes de onda a 450 y 620 nm o a 450 y 690 nm, se
incrementa la precisión de la prueba.
6. Agitar durante 10 seg.Medir en 10 min.
LIMITACIONES DE LA PRUEBA
Los niveles reducidos de vWF:CBA están asociados con el grupo sanguíneo 0.
El vWF:CBA se ve asimismo afectado por el ejercicio físico, el embarazo (el uso de la píldora
anticonceptiva), el grupo étnico y el aumento del antígeno l con la edad.
ADVERTENCIA Y PRECAUCIONES
- Todos los productos sanguíneos o plasmáticos, así como las muestras se deben considerar
potencialmente infecciosos. Se deben tratar con las debidas precauciones de conformidad con los
reglamentos de seguridad biológica vigentes. Los desechos se deberán eliminar como en los
hospitales. Los calibradores y plasmas de control son fabricados con sangre humana y cada plasma
empleado en el procedimiento es HBsAg, HIV 1/2 Ac y HCV-Ac-negativo (véanse las etiquetas en el
kit y/o en los frascos).
- La solución de parada (ácido sulfúrico) puede irritar la piel. En caso de que el ácido alcanzase sus
ojos, láveselos inmediatamente y acuda a un médico
- Los reactivos contienen en ocasiones agentes conservantes (mertiolato). ¡ NO DEBE SER
INGERIDO¡ Evítese el contacto con la piel o membranas mucosas
RESULTADOS DE LOS ANÁLISIS
CÁLCULO DE LOS RESULTADOS
Trazado de una curva de referencia: Eje X: Concentración vWF:CBA U/mL (1 U/mL = 100%)
La curva de referencia es lineal-lineal, únanse los valores ranhura punto al punto ou cúbica
Evaluación de la curva de referencia:
La extinción del coeficiente del calibrador más alto deberá estar de entre 1,0 y 2,5.
La validez de la prueba se puede comprobar sobre la base de los valores de control calculados.
de Ejemplo de curva estándar:
2,5
2
1,5
1
0,5
0
0 0,2 0,4
de
Medición de las muestras de concentración:
• Léase la concentración en la curva de referencia.
• En caso de haber muestras con mayores coeficientes de extinción que el punto estándar más
elevado en la curva, tendrán que ser diluidos previamente con tampón de incubación (1+1). La
concentración medida tiene que multiplicarse por el factor 2 de dilución.
RANGO DE REFERENCIA
Rango normal con respecto al vWF:CBA se encuentra entre 0,4 – 2,5 U/mL (40-250%) (Fig 1)
Se recomienda que los distintos laboratorios establezcan su propio rango normal.
ESTANDARDIZACIÓN
El material de calibración empleado es el estándar internacional de la OMS para el factor VIII de
coagulación de la sangre y el factor von Willebrand en plasma humano.
CARACTERÍSTICAS DE FUNCIONAMIENTO
Los datos de funcionamiento del kit se presentan abajo. Los resultados obtenidos en laboratorios
independientes pueden diferir.
PRECISIÓN
La reproducibilidad se determinó con diferentes muestras (en series y día a día).Se obtuvieron los
siguientes resultados:
Intra assay
Muestra 1
N 24
Mean (U/mL) 1,372
SD (U/mL) 0,020
CV (%) 1,47%
COMPARACIÓN DE MÉTODOS O CORRELACIÓN
El TECHNOZYM vWF:CBA (Technoclone) se correlacionó con dos ensayos que medía 113 muestras
(24 muestras de individuos normales y 89 muestras de pacientes con VWD clasificadas como tipo 1
(n=26), tipo 2A/2B (n=11), tipo 2M (n=45), tipo 2N (n=4) y tipo 3 (n=3).
Con el Asserachrom vWF:CB de Stago (utilizando colágeno humano tipo III) se observó una
correlación de r=0.98, inclinación=0.90. Con el test Collagen Binding Assay de Life Diagnostics
(utilizando 95% de colágeno equino tipo I, 5% tipo III), se observó una correlación de r=0.99,
inclinación= 0.95.
RANGO DEL TEST:
0.01– 1.70 U/mL
Sin embargo, el rango efectivo de cada test realizado dependerá del valor testado del calibrador 1.
LÍMITE DE DETECCIÓN:
0.01 U/mL
LITERATURA
1) Blood 69; 1691 – 1695, 1987. The effect of ABO blood group on the diagnosis of vWD. Gill et al.
2) Thromb Haemost 2000; 83: 127 – 35. Collagen Binding Assay for von Willebrand Factor (VWF:CBA) Detection
of VWD and discrimination of VWD Subtypes, Depends on Collagen Source. E J Favaloro
3) Haemophilia (Suppl. 3), 1998, 15 – 24. The determination of von Willebrand factor activity by collagen binding
assay. Siekmann et al.
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Eje Y: Extinción
0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6
vWF:CBA U/ml
Inter assay
Muestra 2 Muestra 1
24 10
1,630 1,366
0,029 0,074
1,75% 5,39%
ES
Muestra 2
10
0,306
0,013
4,13%