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TECHNOZYM
vWF:CBA ELISA
DESCRIZIONE DEL PRODOTTO
IMPIEGO
Il fattore di Von Willebrand (vWF) è una grossa glicoproteina multifunzionale che gioca un ruolo chiave
nella emostasi primaria. Si presenta a struttura multimerica e ricopre diverse funzioni:
è la proteina vettrice del fattore VIII nel plasma; forma un complesso proteggendo in questo modo il
fattore VIII da una degradazione proteolitica precoce.
fa da mediatore per l'aggregazione piastrinica attraverso l'adesione ai recettori di membrana (GP Ib
GP IIb/IIIa) in seguito a precedente attivazione piastrinica.
gioca un ruolo importante nell'emostasi primaria facendo da mediatore
per l'adesione delle piastrine al sottoendotelio (parete vasale danneggiata).
Al fine di individuarne le proprietà adesive si testa comunemente l'aggregazione piastrinica (esame =
test aggregometrico). Questa, tuttavia, non riflette la situazione fisiologica e la funzionalità del vWF.
E' possibile determinare le proprietà adesive del vWF valutando la sua capacità di legarsi al collagene.
La determinazione di un legame vWF-collagene rispecchia la funzione fisiologica del vWF.
COMPONENTI
1.Strip ELISA (12): con 8 pozzetti ciascuno; ricoperti di collagene umano del tipo III; confezionati in
bustine di alluminio con disseccante.
2. Tampone di lavaggio concentrato: (PBS; pH 7,3); contenente detergente; 0,01% mertiolato; 1
bottiglia; 80 mL.
3. Tampone di incubazione: (PBS; pH 7,3); di colorante, contiene proteina stabilizzante; Proclin 300; 1
bottiglia; 90 mL; pronto all'uso.
4. Calibratori (Standards): numerati; liofilizzati;una bottiglia di ciascuno.
Le concentrazioni dipendono dai lotti: fare riferimento all'etichetta sulla bottiglia!
5. Plasmi di controllo "high level" e "low level": per il controllo di accuratezza; liofilizzati; una bottiglia di
ciascuno.
Le concentrazioni dipendono dai lotti: fare riferimento all'etichetta sulla bottiglia!
6. Coniugato: anticorpi anti-vWF policlonali-POX (perossidasi); di colore azzurro; 1 bottiglia; 0,3 mL
7. Substrato cromogeno: TMB (tetrametilbenzidina) 1 bottiglia, 12 mL, pronto all'uso
8. Soluzione di arresto: acido solforico 1,9 mol/L; 1 bottiglia; 12 mL, pronta all'uso
9. Pellicola adesiva: per strip ELISA, 2 pezzi
MATERIALE NECESSARIO
(non incluso nel kit)
1. Acqua distillata
2. Provette per la diluizione dei calibratori e dei campioni
3. Cilindro graduato (1000 mL)
4. Pipette di precisione (10, 100 und 1000 µL)
5. Pipetta variabile (1000 µL)
6. Pipette multicanale e dispensatori multipli (100 und 200 µL)
7. Lavatore ELISA o pipetta multicanale
8. Lettore ELISA con filtro 450 nm (e filtro di riferimento a 620 nm se disponibile)
CONSERVAZIONE E STABILITA'
Tutti i componenti contenuti nella confezione sono utilizzabili fino alla data di scadenza indicata. Per la
stabilità dei componenti dopo l'apertura, la ricostituzione e la diluizione consultare la tabella qui di
seguito riportata.
Se necessario, i campioni, i controlli e i calibratori possono essere congelati e scongelati fino a cinque
volta che. Si raccomanda tuttavia di suddividerli in adeguate aliquote.
Materiale/Reagente
Stato
Calibratori,
Dopo la ricostituzione
plasmi di controllo
Strip ELISA
Dopo l'apertura
Tampone
di
lavaggio
Dopo l'apertura
concentrato
Diluizione
Tampone di lavaggio
concentrato 1+11,5
Tampone di incubazione
Dopo l'apertura
Dopo l'apertura
Coniugato
Soluzione pronta all'uso Temperatura ambiente
Substrato cromogeno
Dopo l'apertura
ESECUZIONE DEL TEST
PREPARAZIONE DEI CAMPIONI DI PLASMA
Materiale: plasma
Come ottenere il plasma: miscelare 9 volumi di sangue venoso con un volume di soluzione di citrato di
sodio (0,11 mol/L) e centrifugare per 15 min. ad un'accelerazione minima relativa di almeno 2500xg
(DIN 58905). Il campione di plasma può essere conservato per tre ore a temperatura ambiente, oppure
congelato immediatamente dopo la centrifugazione. Conservazione a –20°C. Durata: 6 mesi.
PREPARAZIONE DEL REAGENTE
1. Prima di procedere al test portare a temperatura ambiente tutti i componenti necessari.
2. Preparazione del tampone di lavaggio: diluire 1 volume di tampone di lavaggio concentrato con 11,5
volumi di acqua distillata (1+11,5). Miscelare bene! (Tampone di lavaggio concentrato diluito = tampone
di lavaggio). Disciogliere eventuali cristalli ad una temperatura di 37°C per 10 min.
3. Ricostituzione dei calibratori e dei plasmi di controllo: i calibratori e i plasmi di controllo vengono
ricostituiti con 500 µl di acqua distillata e miscelati (agitatore per provette) per 10 secondi dopo un tempo
di ricostituzione di 15 minuti. I componenti ricostituiti sono da trasparenti a leggermente torbidi.
4. Diluizione dei calibratori, dei plasmi di controllo e dei campioni (1+25): diluire 20 µL di campione, 20
µL di calibratori e 20 µL di plasmi di controllo rispettivamente con 500 µL di tampone di incubazione.
Miscelare per 10 secondi!
5. Preparazione della soluzione d'uso del coniugato (1+50): diluire 1 volume di coniugato con 50 volumi
di tampone di incubazione.
Per 8 pozzetti: miscelare 20 µL di coniugato con 1000 µL di tampone di incubazione.
PROCEDURA DEL TEST
Pipettare i calibratori, i plasmi di controllo
INCUBAZIONE CAMPIONI
e i campioni diluiti nei pozzetti.
(indicazioni 1,2)
Coprire gli strip con pellicola
Incubare a temperatura ambiente
LAVAGGIO (indicazioni 1,3,4)
Tampone di lavaggio
Pipettare la soluzione d'uso del coniugato
REAZIONE CONIUGATO
nei pozzetti. Coprire gli strip con pellicola
(indicazioni 1,2)
Incubare a temperatura ambiente
LAVAGGIO (indicazioni 1,3,4)
Tampone di lavaggio
Pipettare la soluzione di substrato nei
REAZIONE
SUBSTRATO
pozzetti; Coprire gli strip con pellicola nuova
(indicazioni 1,2)
Incubare a temperatura ambiente
Pipettare la soluzione di arresto nei
ARRESTO (indicazioni 1,2)
pozzetti
MISURAZIONE (indicazione 5 6)
Lettore ELISA, 450nm
Conservazione
Stabilità
Temperatura ambiente
8 ore
-20°C
6 mesi
2 ... 8 °C con pellicola adesiva
Fino alla data
in bustine di alluminio con
di scadenza
disseccante
2 ...8°C
6 mesi
del
2 ... 8 °C
3 settimane
2 ... 8 °C
2 mesi
2 ... 8 °C
6 mesi
60 minuti
Fino alla data
2 ... 8 °C
di scadenza
100 µL
45 minuti
3x200 µL
100 µL
45 minuti
3x200 µL
100 µL
15 minuti
100 µL
Indicazioni
1. Non miscelare reagenti di lotti diversi.
2. La precisione e il recupero dipendono fra l'altro in modo decisivo anche dai seguenti fattori:
Buona miscelazione di tutte le soluzioni diluite, 10 sec. nell'agitatore
Esecuzione in doppio delle determinazioni
Incubazione a temperatura corretta (Temperatura ambiente: 20...25 °C)
Rispetto scrupoloso dell'ordine di pipettamento e dei tempi indicati:
I tempi di incubazione dei campioni e della reazione del coniugato e del substrato indicati vengono
presi a partire dal pipettamento dell'ultimo campione. I tempi di incubazione non dovrebbero variare
più del ± 10% .
Nell'incubazione dei campioni e nella reazione del coniugato, il tempo per il pipettamento dei
calibratori/campioni/plasmi di controllo e soluzione del coniugato non deve superare i 60 sec. per
strip-ELISA (8 pozzetti).
Nella reazione del substrato e nell'arresto il tempo di pipettamento della soluzione di substrato e di
arresto non deve superare i 10 sec. per strip ELISA. L'utilizzo di pipette multicanale e di dispensatori
multipli permette di ridurre i tempi di pipettamento.
3. Contrassegnare gli strip con pennarello indelebile nell'evenienza che questi possano cadere per
errore dal supporto nel corso del test.
4. Dopo l'ultimo lavaggio svuotare completamente i pozzetti e capovolgerli su carta assorbente.
5. La precisione del test aumenta effettuando una misurazione della differenza nella lunghezza d'onda
a 450 nm e 620 nm (oppure 690nm).
6. Agitare per 10 sec., misurazione entro 10 minuti
LIMITAZIONI DEL TEST
Il gruppo sanguigno 0 è associato a livelli bassi di vWF:CBA.
vWF:CBA è anche condizionato da attività fisica, gravidanza (da contraccettivi orali), appartenenza a
determinati gruppi etnici e dall'aumento dell'antigene legato all'età.
AVVERTENZE E NORME DI SICUREZZA
-
Tutti gli emoderivati di origine umana, così come i campioni, devono essere considerati
potenzialmente infetti. Devono essere maneggiati con la cura necessaria ed in conformità alle norme
di sicurezza vigenti e smaltiti come rifiuti ospedalieri. I calibratori e i controlli, ricavati da sangue
umano, ed ogni singolo plasma utilizzato nel test sono HbsAg, HIV Ak e HCV-Ak negativi (vedere
etichetta esterna e sulla bottiglia)).
-
La soluzione di arresto (acido solforico) può irritare la pelle. In caso di contatto con gli occhi
sciacquare abbondantemente con acqua e consultare un medico.
-
I reagenti contengono una parte di conservante (mertiolato). Non ingerire! Evitare il contatto con la
pelle e le mucose!
RISULTATI DELL'ANALISI
LETTURA DEI RISULTATI
Costruzione di una curva di riferimento: asse X: concentrazione vWF:CBA U/mL
La curva di riferimento è lineare-lineare, i valori sono punto per punto o con „ spline cubica"
Valutazione della curva di riferimento
L'estinzione del calibratore più elevato dovrebbe posizionarsi fra 1,0 e 2,5.
La validità del test potrà essere testata in base ai valori di controllo rilevati.
Esempio di curva standard:
2,5
2
1,5
1
0,5
0
0
0,2
0,4
0,6
0,8
vWF:CBA U/ml
Determinazioni della concentrazione dei campioni
Ricavare le concentrazioni dei campioni dalla curva di riferimento.
Nel caso in cui il coefficiente di estinzione di un campione dovesse essere più alto di quello dello
standard più elevato, allora occorrerà diluire il campione (1+1). In tal caso la concentrazione
ricavata verrà moltiplicata per il fattore di diluizione 2.
VALORI DI RIFERIMENTO
Il valore normale del vWF:CBA è compreso fra 0,4 – 2,5 U/mL (40-250%) (Fig 1)
Si raccomanda a ciascun laboratorio di stabilire i propri intervalli di riferimento.
STANDARDIZZAZIONE
Il materiale di calibrazione utilizzato rispetta lo standard internazionale previsto dall'Orgamizzazione
mondiale della Sanità per il fattore VIII di coagulazione e il vWF nel plasma umano.
PERFORMANCE DEL TEST
Di seguito sono riportate le performance di riferimento del test. I risultati ottenuti possono differire da un
laboratorio all'altro.
PRECISIONE
La riproducibilità è stata determinata analizzando diversi campioni (in serie e giorno per giorno).
Sono stati ottenuti i seguenti risultati:
Intra assay
Campione 1
N
24
Mean (U/mL)
1,372
SD (U/mL)
0,020
CV (%)
1,47%
METODI A CONFRONTO E CORRELAZIONI
La correlazione tra TECHNOZYM vWF:CBA (Technoclone) e altri due dosaggi è stata effettuata
analizzando 113 campioni [24 campioni da soggetti normali e 89 campioni sa pazienti con VWD
classificate come Tipo 1 (n=26), Tipo 2A/2B (n=11), Tipo 2M (n=45), Tipo 2N (n=4) e Tipo 3 (n=3)].
E' stata osservata una correlazione r=0.98, pendenza=0.90 con il kit Asserachrom vWF:CB (Stago) che
utilizza Collagene Umano Tipo III. Una correlazione r=099, pendenza=0.95 è stata osservata con il kit
Collagen Binding Assay (Life Diagnostic) che utilizza collagene Equino di Tipo I (95%) e di tipo III (5%).
INTERVALLO:
0.01 – 1.70 U/mL
In ogni caso l'intervallo effettivo di ogni dosaggio dipenderà dai valori ottenuti per il calibratore 1.
LIMITE DI RILEVAZIONE:
0.01 U/mL
BIBLIOGRAFIA
1) Blood 69; 1691 – 1695, 1987. The effect of ABO blood group on the diagnosis of vWD. Gill et al.
2) Thromb Haemost 2000; 83: 127 – 35. Collagen Binding Assay for von Willebrand Factor (VWF:CBA) Detection
of VWD and discrimination of VWD Subtypes, Depends on Collagen Source. E J Favaloro
3) Haemophilia (Suppl. 3), 1998, 15 – 24. The determination of von Willebrand factor activity by collagen binding
assay. Siekmann et al.
4 / 8
(1 U/mL = 100%)
asse Y: estinzione
1
1,2
1,4
1,6
Inter assay
Campione 2
Campione 1
Campione 2
24
10
10
1,630
1,366
0,306
0,029
0,074
0,013
1,75%
5,39%
4,13%
IT
